HIF-1 is involved in metabolic reprogramming and inflammatory response induced by D-lactate in bovine synoviocytes and neutrophils

Abstract

Cattle develop laminitis and aseptic polysynovitis as consequences of acute ruminal acidosis (ARA), both being acute inflammatory processes that cause claudication and lameness. During ARA events, D-lactate reaches levels greater than 5 mM in synovial fluid, suggesting its involvement in the pathophysiology of aseptic polysynovitis. Along with inflammatory alterations, the synovial fluid of these animals also shows several metabolic disturbances, mainly associated with carbohydrate metabolism, including alterations in glycolysis/gluconeogenesis, starch and sucrose metabolism, galactose metabolism and pyruvate metabolism. Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) exerts a strong regulation on glycolysis and could be involved in the development of ARA-associated aseptic polysynovitis. The aim of this study was to elucidate the role of HIF-1 in the inflammatory and metabolic alterations induced by D-lactate in bovine synoviocytes and neutrophils, the main cellular effectors of aseptic polysynovitis. D-lactate triggered the production of IL-6, IL-8 and PGE2 in synoviocytes, as well as neutrophil extracellular traps (NET) formation in neutrophils. Along with these inflammatory responses, D-lactate induced changes in metabolism of both cells, mainly associated with glycolysis/gluconeogenesis, starch and sucrose metabolism and galactose metabolism. In agreement with these metabolic alterations, D-lactate increased the mRNA expression of L-LDHA, PDK-1, GYS-1 and PYGL in both cells, although Glut-1 expression was only induced in synoviocytes. Furthermore, intracellular glycogen levels in neutrophils were higher under hypoxia and fell dramatically after D-lactate exposure. D-lactate treatment induced the protein accumulation of HIF-1α in synoviocytes and neutrophils under normoxic conditions, although it did not depend on its higher gene expression in neutrophils. HIF-1 regulated the overexpression of Glut-1, PDK-1 and L-LDHA induced by D-lactate in both cells, but only participated in GYS-1 and PYGL expression under hypoxia. In addition, the NET formation in neutrophils and IL-6 production in synoviocytes after D-lactate exposure were inflammatory responses regulated by HIF-1. D-lactate also induced phosphorylation of Akt and GSK-3β (Serine 9). PI3K/Akt axis was essential for HIF-1α accumulation in synoviocytes and neutrophils, also exerting a strong regulation in the metabolic enzymes expression and the inflammatory responses evaluated. On the other hand, GSK-3β only regulated the HIF-1α accumulation in synoviocytes. Pharmacological inhibition of GSK-3β did not decrease the production of IL-6, IL-8 and PGE2, as well as the expression of Glut-1 and PDK-1 induced by D-lactate in synoviocytes, although it did reduce the expression of L-LDHA. In contrast, both NETosis and mRNA expression of Glut-1, PDK-1, L-LDHA, GYS-1 and PYGL were dependent on GSK-3β in neutrophils exposed to D-lactate. These results suggest the involvement of HIF-1 in the metabolic and inflammatory alterations triggered by D-lactate in bovine synoviocytes and neutrophils, which would be key in pathophysiology of ARA-associated polysynovitis and show a close relationship between inflammation and metabolism.

Como consecuencia de la acidosis ruminal aguda (ARA) los bovinos desarrollan laminitis y polisinovitis aséptica, procesos inflamatorios agudos que causan claudicación y cojera. Durante los eventos de ARA, D-lactato alcanza concentraciones mayores a 5 mM en el líquido sinovial, lo cual sugiriere su involucramiento en la fisiopatología de la polisinovitis aséptica. Junto con las alteraciones inflamatorias, el líquido sinovial de estos animales también muestra disturbios metabólicos, principalmente asociados al metabolismo de carbohidratos, entre ellos alteraciones en la glicólisis/gluconeogénesis, metabolismo del almidón y la sacarosa, metabolismo de la galactosa y metabolismo del piruvato. El factor de transcripción inducible por hipoxia 1 (HIF-1) ejerce una fuerte regulación sobre el metabolismo glicolítico y podría estar involucrado en el desarrollo de la polisinovitis aséptica asociada a ARA. El objetivo de este trabajo fue dilucidar el rol de HIF-1 en las alteraciones inflamatorias y metabólicas inducidas por D-lactato en sinoviocitos y neutrófilos bovinos, los principales efectores celulares de la polisinovitis aséptica. D-lactato gatilló la producción de IL-6, IL-8 y PGE2 en sinoviocitos, así como la formación de trampas extracelulares de DNA (NETs) en neutrófilos. Asociado a estas respuestas inflamatorias, D-lactato indujo cambios en el metabolismo de ambas células, principalmente asociadas a la glicólisis/gluconeogénesis, metabolismo del almidón y la sacarosa y metabolismo de la galactosa. En concordancia con estas alteraciones metabólicas, D-lactato aumentó la expresión de L-LDHA, PDK-1, GYS-1 y PYGL en ambas células, aunque la expresión de Glut-1 sólo fue inducida en sinoviocitos. Además, los niveles intracelulares de glicógeno en los neutrófilos fueron mayores en hipoxia y cayeron drásticamente tras la exposición a D-lactato. El tratamiento con D-lactato indujo la acumulación proteica de HIF-1α en sinoviocitos y neutrófilos en condiciones normóxicas, aunque en neutrófilos no dependió de su mayor expresión génica. HIF-1 reguló la sobreexpresión de Glut-1, PDK-1 y L-LDHA inducida por D-lactato en ambas células, pero sólo participó en la expresión de GYS-1 y PYGL en hipoxia. Además, la formación de NETs en neutrófilos y la producción de IL-6 en sinoviocitos tras la exposición a D-lactato fueron respuestas inflamatorias reguladas por HIF-1. D-lactato también indujo la fosforilación de Akt y de GSK-3β (Serina 9). La activación del eje PI3K/Akt fue esencial para la acumulación de HIF-1α en sinoviocitos y neutrófilos, ejerciendo además una fuerte regulación en la expresión de las enzimas metabólicas y las respuestas inflamatorias evaluadas. Por su parte, GSK-3β sólo reguló la acumulación de HIF-1α en sinoviocitos. La inhibición farmacológica de GSK-3β no redujo la producción de IL-6, IL-8 y PGE2, así como tampoco la expresión de Glut-1 y PDK-1 inducidas por D-lactato en sinoviocitos, aunque disminuyó la expresión de L-LDHA. En forma contraria, tanto la NETosis como la expresión de Glut-1, PDK-1, L-LDHA, GYS-1 y PYGL en los neutrófilos expuestos a D-lactato fueron dependientes de GSK-3β. Los resultados de este trabajo sugieren la participación de HIF-1 en las alteraciones metabólicas e inflamatorias gatilladas por D-lactato en sinoviocitos y neutrófilos, las cuales parecen ser claves en la fisiopatología de la polisinovitis asociada a ARA y evidencian la estrecha relación existente entre inflamación y metabolismo.